初级检验技士辅导：细菌的代谢试验

　　初级检验技士辅导：细菌的代谢试验

　　细菌对于碳水化合物的代谢试验原理为：由于细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。具体试验方法有：①糖类发酵试验是鉴定细菌最常用的生化反应，特别是对肠杆菌的鉴定尤为重要;②葡萄糖代谢类型鉴别试验;③七叶苷水解试验;④淀粉水解试验;⑤甲基红试验;⑥V-P试验;⑦β-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)。

　　1.糖(醇、苷)类发酵试验

　　(1)原理：由于各种细菌含有发酵不同糖(醇、苷)类的酶，故分解糖类的能力各不相同，有的能分解多种糖类，有的仅能分解1～2种糖类，还有的不能分解。细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。

　　(2)培养基：在培养基中加入0.5%～1%的糖类(单糖、双糖或多糖)、醇类(甘露醇、肌醇等)、苷类(水杨苷等)。培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。

　　(3)方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖(醇、苷)类发酵培养基中，置培养箱中培养数小时至两周后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应保持湿度，以免培养基干燥。

　　(4)结果：接种的细菌，若能分解培养基中的糖(醇、苷)类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。

　　(5)应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。

　　2.氧化-发酵试验(O/F试验)

　　(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。

　　(2)培养基：Hugh-Leifson培养基。

　　(3)方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡(或其他矿物油)，高度不少于1cm.将培养基于35℃培养48h或更长。

　　(4)结果：两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型;两支培养基均产酸为发酵型;若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。

　　(5)应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。

　　3.β-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)

　　(1)原理：有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)，而生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下也可检出。

　　(2)试剂：0.75M ONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸馏水中，在加入缓冲液(6.9g NaH2P04溶于45ml蒸馏水中，用30% NaOH调整pH为7.0，再加水至50ml)5ml，置4℃冰箱中保存。0NPG溶液为无色，如出现黄色，则不应再用。

　　(3)方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5min，加入0.25ml ONPG试剂，水浴20min～3h观察结果。

　　(4)结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min内显色。

　　(5)应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。

　　4.七叶苷水解试验

　　(1)原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的二价铁离于反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。

　　(2)培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。

　　(3)方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。

　　(4)结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。

　　(5)应用：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。也可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。

　　5.甲基红试验

　　(1)原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质(如醇、酮、醚、气体和水等)，则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。

　　(2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。

　　(3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养2～4d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。　　(4)结果：呈现红色为阳性;橘红色为弱阳性;黄色为阴性。

　　(5)应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。

　　6.V-P试验

　　(1)原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，被空气中的氧氧化为二乙酰，进而与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，则为V-P试验阳性。若培养基中胍基含量较少，则可加入少量含胍基化合物，如肌酸或肌酐等。试验时加入a-萘酚可加速此反应。

　　(2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。

　　(3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35℃培养48h后加入甲液(6% α-萘酚酒精溶液)和乙液(40% KOH溶液)，振摇。

　　(4)结果：在数分钟内出现红色为阳性;如无红色出现且于35℃4h后仍如故者即为阴性。

　　(5)应用：本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。

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