2012年初级检验技士辅导：培养基的制备程序

　　培养基的制备程序不同类型培养基制备的程序也不尽相同。但一般培养基的程序主要可分为：配料、溶化、矫正pH、澄清过滤、分装、灭菌及检定等8个步骤。$lesson$

　　(一)配料

　　按培养基处方准确称取各种成分，先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入各种成分，以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水冲洗瓶壁。

　　(二)溶化

　　将各种成分混匀于水中，最好以流通蒸气溶化半小时，如在电炉上溶化应随时搅拌，如有琼脂成分时更应注意防止外溢。溶化完毕，补足失去的水分。

　　(三)矫正pH

　　1.pH测定

　　取与标准管同口径的试管(通常用华氏试管)3支，于第1、3管各加入欲测定pH的的培养基5ml，并于第一管中加入0.2g/L的酚红0.25ml作为测定管，混匀;于第2管加入蒸馏水5ml，第4管为pH标准比色管。

　　2.pH的校正

　　若测定管过酸或过碱可用0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L盐酸溶液矫正，直至颜色与标准管相同为止，加碱或加酸时要精确缓慢，每加1滴后要充分混匀，比色后再加第2滴(有时仅加半滴)准确记录加入的量。

　　3.计算

　　设5ml培养基矫正pH至7.4时需0.1mol/L氢氧化钠0.15ml，现有培养基4990ml，需加氢氧化钠的量可按下列方法计算：5∶4990=0.15∶X

　　X=0.15×4990/5=149.7(ml)

　　如将此0.1mol/L的氢氧化钠改用1mol/L的氢氧化钠时，则需14.9ml即可。

　　(四)过滤澄清

　　培养基配制后一般都有沉渣或混浊出现，需过滤成清晰透明后方可使用，常用的过滤方法如下：

　　1.液体培养基

　　液体培养基必须清晰，以便观察细菌的生长情况，常用滤纸过滤，亦可在加热前加入用水稀释的鸡蛋白(1000ml培养基用1个鸡蛋白)在100℃加热后保持60～70℃40～60分钟，使其不溶性物质附于凝固的蛋白上而沉淀，然后再用虹吸法吸出上清液或以滤纸过滤。

　　2.固体培养基

　　如系琼脂培养基，于加热融化后需趁热以绒布或两层纱布中夹脱脂棉过滤;亦可用

　　自然沉淀法，即将琼脂培养基盛人铝锅或广口搪瓷容器内，以高压(103.43kPa)蒸汽融化15分钟后，静置高压锅内过夜，次日将琼脂倾出，用刀将底部沉渣切去，再融化即可收清晰的琼脂培养基。

　　(五)分装

　　1.根据需要将培养基分装于不同容量的三角烧瓶、试管中。分装的量不宜超过容器的2/3以免灭菌时外溢。

　　2.琼脂斜面分装量为试管容量的1/5，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长约为试管长的2/3.

　　3.半固体培养基分装量约为试管长的1/3，灭菌后直立凝固待用。

　　4.高层琼脂分装量约为试管的1/3，灭菌后趁热直立，待冷后凝固待用。

　　5.液体培养基分装于试管中，约是试管长度的1/3.

　　6.琼脂平板：将灭菌(或加热融化)后的培养基冷至50℃左右，以无菌手续倾人灭菌平皿内，内径9cm的平皿倾注培养基约13～15ml，轻摇平皿底，使培养基平铺于平皿底部，待凝固后即成，倾注培养基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌落入。

　　新制成的平板培养基(简称平板)，表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将平皿倒扣搁置于37℃培养箱内约30分钟待平板平面干燥后使用。

　　(六)灭菌

　　不同成分、性质的培养基，可采用不同的灭菌方法。高压蒸汽灭菌法：高压灭菌的温度与时间随培养基的种类及数量的不同有所差别，

　　一般培养基少量分装时高压(103.43kPa)灭菌15分钟即可，培养基分装量较大时，可高压(103.43kPa)灭菌30分钟，含糖的培养基高压(55.16kPa)灭菌15分钟。以免糖类被破坏。

　　(七)检定

　　每批培养基制成后须经检定方可使用，检定时将培养基放37℃温箱内培养24小时后，证明无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上生长繁殖及生化反应情况，符合要求者方可使用。

　　(八)保存

　　制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤做为宜。每批应注明名称，分装量，制作日期等，放在4℃冰箱内备用。

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