2018初级药师资格考试《相关专业知识》复习讲义第九章

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　　第九章 生物技术药物制剂

　　第一节概述

　　一、生物技术的基本概念

　　1、生物技术或称生物工程(biotechnology)，是应用生物体(包括微生物、动物细胞， 植物细胞)或其组成部分(细胞器和酶)，在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。

　　2、现代生物技术主要包括基因工程、细胞工程与酶工程、发酵工程(微生物工程)与生 化工程。

　　二、生物技术药物的结构特点与理化性质

　　(一)蛋白质的结构特点 蛋白质的组成和一般结构(一、二、三、四级结构)(二)蛋白质的理化性质

　　1.蛋白质的一般理化性质：旋光性、紫外吸收、蛋白质两性本质与电学性质

　　(1)旋光性：蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。

　　(2)紫外吸收：大部分蛋白质均含有带苯核的苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm显示强吸收。

　　(3)蛋白质两性本质与电学性质：蛋白质除了肽链N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，如赖氨酸的-氨基，谷氨酸的γ羧基等。这些基团在一定 pH条件下都能发生解离而带电。因此蛋白质是两性电解质，在不同 pH条件下蛋白质会成为阳离子、阴离子或二性离子。

　　2.蛋白质的不稳定性

　　(1)由于共价键引起的不稳定性：水解、氧化和消旋化，此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键的断裂与交换

　　(2)由非共价键引起的不稳定性：聚集(aggregation)、宏观沉淀、表面吸附与蛋白质变性

　　(三)蛋白质类药物的评价方法： 多种分析方法：液相色谱法、光谱法、电泳、生物活性测定与免疫测定

　　第二节 蛋白质类药物制剂的处方与工艺(注射剂型)

　　一、蛋白质类药物的一般处方组成：一类为溶液型注射剂，另一类是冻干粉注射剂

　　二、液体剂型中蛋白质类药物的稳定化：①改造其结构;②加入适宜辅料 蛋白类药物的稳定剂：缓冲液、表面活性剂、糖和多元醇、盐类、聚乙二醇类、大分子化合物、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的盐酸盐等、金属离子

　　1.缓冲液 因为蛋白质的物理化学稳定性与pH值有关，通常蛋白质的稳定pH值范围很窄，应采用适当的缓冲系统，以提高蛋白质在溶液中的稳定性。例如红细胞生成素采用枸橼酸钠-枸橼酸缓冲剂，而α-N3干扰素则用磷酸盐缓冲系统，人生长激素在5mmol/L的磷酸盐缓冲液可减少聚集。缓冲盐类除了影响蛋白质的稳定性外，其浓度对蛋白质的溶解度与聚集均有很大影响。组织溶纤酶原激活素在最稳定的pH条件下，药物的溶解度不足以产生治疗效果，因此加入带正电荷的精氨酸以增加蛋白质在所需pH值下的溶解度。

　　2.表面活性剂 由于离子型表面活性剂会引起蛋白质的变性，所以在蛋白质药物，如α-2b干扰素、G-CSF、组织溶纤酶原激活素等制剂中均加入少量非离子表面活性剂，如吐温80来抑制蛋白质的聚集，其机理可能是因为表面活性剂倾向于排列在气—液界面上，从而使蛋白质离开界面来抑制蛋白质的变性。

　　3.糖和多元醇 糖和多元醇属于非特异性蛋白质稳定剂。蔗糖、海藻糖、甘油、甘露醇、山梨醇(浓度1%~10%)最常用。糖和多元醇的稳定作用与其浓度密切相关，不同糖和多元醇的稳定程度取决于蛋白质的种类。还原糖与氨基酸有相互作用，因此避免使用。

　　4.盐类 盐可以起到稳定蛋白质的作用，有时也可以破坏蛋白质的稳定性，这主要取决于盐的种类、浓度、离子相互作用的性质及蛋白质的电荷。低浓度的盐通过非特异性静电作用提高蛋白质的稳定性。如SO42-、HPO42-、CHCOO-、(CH3)N+、NH4+、K+、Na+等能增加溶液的离子强度，提高疏水作用，降低疏水基团的溶解度，使蛋白质发生盐析。此外它们使水分子聚集在蛋白质周围被优先水化，所有这些都使蛋白质更加紧密稳定。经常使用的盐NaCl在稳定蛋白质中起关键作用，实验表明它能提高牛血清白蛋白(BSA)的变性温度和热焓。

　　5.聚乙二醇类 高浓度的聚乙二醇类常作为蛋白质的低温保护剂和沉淀结晶剂。研究表明不同分子量的PEG作用不同，如PEG300浓度0.5%或2%可抑制重组人角化细胞生长因子(rhKGF)的聚集;PEG200、400、600和1000可稳定BSA和溶菌酶。

　　6.大分子化合物 研究表明很多大分子化合物具有稳定蛋白质的作用。其机制可能是通过大分子的表面活性、蛋白质-蛋白质相互作用的空间隐蔽以及提高粘度来限制蛋白质运动或通过优先吸附于大分子以起到稳定作用，人血清白蛋白(HAS)已在许多蛋白质类生物技术来源的药物制剂中作稳定剂。近年来也有采用环糊精制成包合物来增加蛋白质药物的溶解度，例如用2-羟丙基--环糊精是较有前途的稳定剂，其本身又是增溶剂可静脉注射，可用来抑制hGH的界面变性，抑制rhKGF的聚集，稳定白介素-2和牛胰岛素等。

　　7.组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的盐酸盐等 可不同程度地抑制45℃ 10 mM磷酸盐缓冲液中rhKGF的聚集。

　　8.金属离子 一些金属离子，如钙、镁、锌与蛋白质结合，使整个蛋白质结构更加紧密、结实、稳定。不同金属离子的稳定作用视离子的种类、浓度不同而不同，应通过稳定性实验选择金属离子的种类和浓度。

　　三、固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺 (一)冷冻干燥蛋白质药物制剂：在蛋白质类药物冻干过程中常加入某些冻干保护剂来改善产品的外观和稳定性，如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、右旋糖酐等。 (二)喷雾干燥蛋白质药物制剂：操作过程中损失大(特别是小规模生产)，水分含量高。

　　第三节 蛋白质类药物新型给药系统

　　一、新型注射(植入)给药系统

　　(一)控释微球制剂：复乳液中干燥法、低温喷雾提取法、喷雾干燥法、超临界萃取法

　　1.复乳液中干燥法

　　将药物与保护剂(多为水溶性高分子聚合物)溶于水作为水相，将聚酯(如PLA、PLGA等)类高分子材料溶于二氯甲烷作为油相，两者在一定温度下(低于40℃)高速搅拌得W/O型初乳，冰浴冷却至10℃以下，倒至一定浓度的PVA水溶液中，经高速搅拌得W/O/W型复乳，一定温度下搅拌蒸去有机溶剂固化微球(或减压去有机溶剂)，离心水洗，真空干燥即得。该方法是制备多肽、蛋白质等生物大分子药物微球的常用方法，其特点为药物包封率较高，药物活性损失小，设备和工艺简单，但首日突释明显，较难放大生产，目前用此法研究制备的药物有γ干扰素、白细胞介素、亮丙瑞林、人生长激素、环孢素以及促红细胞生长素(EPO)等。

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　　2.低温喷雾提取法

　　将生物大分子药物与保护剂的均匀粉末加至生物可降解性聚合物的有机溶剂(如二氯甲烷)中混合形成混悬液，将此混悬液经喷头雾化后喷入冰冻的乙醇溶液(该溶液可与上述溶液混溶，但聚合物不溶于此溶液)，在低温(-70℃)状态下，聚合物载体中的有机溶剂在乙醇中不断扩散完全，分离微球，低温干燥除去乙醇得粉末状微球，该方法的特点：包封率高，微球粒径集中，工艺稳定，可实现产业化，但其活性损失较复乳液中干燥法大。

　　3.喷雾干燥法

　　将生物大分子药物及其稳定剂的混合粉末(或水溶液)与溶有高分子聚合物的有机溶液混合形成混悬液(或乳浊液)，将此混悬液(或乳浊液)经喷嘴雾化干燥制得微球。为了减少生物活性损失，文献报道采用双喷嘴喷雾干燥装置进行生物大分子药物微球的制备，可明显增加微球的收率，同时可减少多肽、蛋白质类药物的活性损失。该装置具有两个平行喷嘴，其中一个喷嘴喷出药物和聚合物的混悬液(或乳浊液)，另一喷嘴同时喷出5%的甘露醇溶液，将微球包层，这样可避免普通喷雾干燥装置制备微球过程中易粘附器壁的缺陷。

　　4.超临界萃取法

　　超临界萃取技术是从20世纪80年代逐渐发展起来的一门新技术。近年来，超临界萃取技术已在化工、冶金、食品、医药、生物等领域得到广泛应用。超临界流体既具有对溶质有较大溶解度的特点，又具有气体易于扩散和运动的特性。更重要的是在临界点附近，压力和温度微小的变化都可以引起流体密度很大的变化，并相应地表现为溶解度的变化。因此，人们可以利用压力、温度的变化来实现萃取和分离的过程而成为实现药物多组分分离的一种有效方法。人们将此技术应用于微粒给药系统，制备药物的控释聚合物微球、药物结晶的粉末、控释脂质体药物等。在制备微粒中根据聚合物及药物的溶解特性又分为超临界溶液快速膨胀(rapid expansion of supercritical solution，RESS)技术和气体反溶剂(gas antisolution，GAS)技术。RESS技术的操作过程是：将固体物质在一定的温度和压力下溶解在超临界流体中形成溶液，然后将此高压溶液从一个细小的喷嘴(一般喷嘴的内径为几十微米，长约几个毫米)喷射到常压的空间中，由于超临界流体在减压的过程中变成了气体，溶解在其中的溶质就沉淀析出，产生直径从几百纳米到几个微米左右的颗粒。一个典型的成功例子是包埋在聚乳酸小球中的Lovastatin晶体。颗粒的构型可以通过适当改变压力、温度、溶液浓度以及喷嘴几何形装来调节。因此用RESS技术得到的固体颗粒都在微米级而且粒径分布比较均匀。

　　(二)脉冲式给药系统：

　　二、非注射给药系统

　　(一)鼻腔给药系统

　　(二)口服给药系统：纳米囊、胰岛素肠溶软胶囊、胰岛素微球制剂、胰岛素脂质体存在四个问题：①在胃内酸催化降解;②在胃肠道内的酶水解;③对胃肠道粘膜的透过性差;④在肝的首过效应。

　　(三)直肠给药系统(四)口腔粘膜给药系统(五)经皮给药系统(六)肺部给药系统

　　第四节蛋白质类药物制剂的评价方法

　　 一、制剂中药物的含量测定

　　制剂中蛋白质类药物的含量测定可根据处方组成确定，如紫外分光光度法和反相高效液相色谱法常用于测定溶液中蛋白质的浓度，但必须进行方法的适用性试验，在处方中其他物质不干扰药物测定的前提下，将蛋白质类药物制剂溶于1.0N氢氧化钠溶液中后采用292nm波长条件下的紫外分光光度法测定。也可采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、离子交换色谱(IEC)与分子排阻色谱(Size exclusion chromatography，SEC)法测定。

　　二、制剂中药物的活性测定

　　蛋白质类药物制剂中药物的活性测定是评价制剂工艺可行性的重要方面，活性测定方法有药效学方法(如细胞病变抑制法)和放射免疫测定法。前一种方法是利用体外细胞与活性蛋白质多肽的特异生物学反应，通过剂量(或浓度)效应曲线进行定量(绝对量或比活性单位)，该方法具有结果可靠，方法重现性好的特点，是制订药物制剂质量标准最基本的方法。后一种方法是建立在蛋白质类药物的活性部位与抗原决定簇处在相同部位时实施的一种方法，否则活性测定会产生误差。此外也可采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质类药物活性。

　　三、制剂中药物的体外释药速率测定

　　测定控缓释制剂中蛋白质类药物的体外释药速率时考虑到药物在溶出介质中不稳定，多采用测定制剂中未释放药物量的方法。具体方法(以微球为例)是将数个试验组的微球(每个试验组设置数个取样点)置于一定量的溶出介质中，放入37℃振动孵箱中，定时取样离心分离测定微球中药物含量。蛋白质从微球中的释放受介质pH值、离子强度、赋形剂以及转速、温度等条件的影响。

　　四、制剂的稳定性研究

　　蛋白质类药物制剂的稳定性研究应包括制剂的物理稳定性和化学稳定性两个方面，物理稳定性研究应包括制剂中药物的溶解度、释放速率以及药典规定的制剂常规指标的测定，化学稳定性包括药物的聚集稳定性、降解稳定性和生物活性测定。试验方法可参照药物制剂稳定性章节，检测手段根据不同药物的特性选择光散射法、圆二色谱法、电泳法、分子排阻色谱法和细胞病变抑制法等进行测定。

　　五、体内药动学研究

　　由于蛋白质类药物剂量小，体内血药浓度检测的灵敏度要求高，常规体外检测方法不能满足体内血药浓度测定，此外药物进入体内后很快被分解代谢，因此选择合适的检测方法是进行体内药动学研究的关键。对于非静脉给药的控缓释制剂的体内药动学试验可考虑选择放射标记法测定血浆中药物的量，该方法灵敏度高，适合多数蛋白质类药物体内血药浓度的测定。如果药物血药浓度与药效学呈线性关系，也可用药效学指标代替血药浓度进行体内吸收和药动学研究。

　　六、刺激性及生物相容性研究

　　与其他类型药物制剂研究一样，刺激性及生物相容性研究是蛋白质类药物制剂(特别是各类注射剂)研究与开发的重要一环，根据我国SFDA(State Food and Drug Administration)药品注册管理办法规定，皮肤、粘膜及各类腔道用药需进行局部毒性和刺激性试验，各类注射(植入)途径给药剂型除进行局部毒性和刺激性试验外还需进行所用辅料的生物相容性研究，以确保所用辅料的安全性。

　　思考题： 1、何谓生物技术制剂

　　2、以蛋白质药物制剂为例，试述其一般处方组成及如何增强其药物稳定性

　　小结： 1、掌握生物技术药物制剂的概念;

　　2、熟悉蛋白质类药物制剂的处方与工艺及稳定性考察。

　　3、了解蛋白质药物的结构特点、理化性质及新的给药系统及评价方法。

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